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PAGE/聚丙烯酰胺凝胶电泳的常见问题理会(FAQ)
浏览: 发布日期:2021-02-27

SDS-PAGE电泳的常见问题理会(FAQ)

SDS-PAGE道理步调

卵白表达系统专题

1.关于凝胶的一些问题

胶的凝聚欠好,譬喻有斑纹出格是浓度高的胶在冬天温度较低的环境下,在疏散胶的下部有海浪样的斑纹,凝胶不匀称。办理要领:加大TEMED和过硫酸胺的量,使其凝聚速度加速。同时洗清洁玻璃板,防备有残留的胶干结在玻璃板上。

胶不凝,办理要领:温度较低时加大TEMED和过硫酸胺的量,过硫酸胺必需新鲜配制。如若照旧不可从头配制一下缓冲溶液。

胶易碎,譬喻浓度较高的胶在染色和脱色进程以及扫描进程中割裂。办理要领:首先在上述进程中必然要行动轻缓,其次在室温较高的环境下可以适当淘汰TEMED和过硫酸胺的量。

电泳完后胶上有许多长条纹的杂带,办理要领:发起电泳缓冲液不要接纳操作。配制胶的溶液必然要纯。

2.凝胶时间差池

凡是胶在30分钟到1小时内凝。假如凝的太慢,大概是TEMED,AP剂量不足。 假如凝的太快,大概是AP和TEMED用量过多,此时胶太硬易裂,电泳时易烧胶。

3.浓缩胶与疏散胶断裂、板间有气泡对电泳的影响

前者主要原因是拔梳子用力不匀称或过猛所致;后者是由于在清除制胶的夹子后,板未压紧而致氛围进入引起的,一般对电泳功效不会有太大的影响。

4.样品的处理惩罚

按照样品疏散目标差异,主要有三种处理惩罚要领:还原SDS处理惩罚、非还原SDS处理惩罚、带有烷基化浸染的还原SDS处理惩罚。

还原SDS处理惩罚:在上样buffer中插手SDS和DTT(或Beta巯基乙醇)后,形成SDS与卵白相团结的分子。

带有烷基化浸染的还原SDS处理惩罚:碘乙酸胺的烷基化浸染可以很好的掩护SH基团,获得较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT,而防备纹理现象的发生。100uL样品缓冲液中插手10uL20%的碘乙酸胺,并在25℃下收藏30min。

非还原SDS处理惩罚:生理体液、血清、尿素等样品,一般只用1%SDS滚水中煮3min,未加还原剂,因而卵白折叠未被粉碎,不行作为测定分子量来利用。

5.条带双方翘起中间凹下的原因(︶)

在较厚的凝胶中,由于凝胶不匀称冷却,龙8游戏,中间部门凝固欠好。

电泳系统温度偏高。

处理惩罚步伐:待其充实凝固再作后续尝试。

6.条带双方向下中间兴起的原因(︵)

一般原因是两板之间的底部间隙气泡未解除清洁,或聚合不完全。

处理惩罚步伐:可在两板间插手适量缓冲液,以解除气泡。

7.条带偏斜

原因:电极不服衡可能加样位置偏斜。

8.条带双方扩散

原因:加样量过多。

9.电泳的条带过粗

电泳中条带很粗是常见的事,主要是浓缩胶的原因。

处理惩罚步伐:适当增加浓缩胶的长度;担保浓缩胶贮液的pH正确;适当低落电压。

10.目标卵白质条带恍惚

电泳凝胶浓度选择不妥。

低于10Kd的小分子卵白质要用Tricine胶。

接近前沿的电泳带判别率不佳。按照分子量与凝胶孔径的干系,选择适当浓度的凝胶。

卵白质样品水解。留意撤除卵白质样品的内源性的水解酶,不要重复冻融。

电泳时间过长或过短。溴酚蓝到达疏散胶的底部即应该封锁电泳电源。

缓冲溶液、SDS都要新鲜配制。

制止加样过多,提高判别率。小体积样品可给出窄带,加样体积按照样品浓度和凝胶厚度机动把握。一般上样体积为10-15uL(即2-10ug卵白质)。

加热变性后的卵白质样品要安排到室温即电泳,不要久放,因为卵白质的二硫键在高温下大概是会断开,可是袒露于氛围中温度低落会从头形成二硫键,并且大概在过久安排进程中卵白质大概会再折叠,更不要扔到冰箱里生存。

11.“鬼带”的呈现及处理惩罚

“鬼带”就是在跑构象巨大的卵白质大分子时,在泳道顶端呈现一些未知条带或在加样孔底部生成沉淀,这主要是因为还原剂在加热的进程中被氧化失活,使解离的卵白质分子从头折叠和亚基从头缔合,由于其分子量凡是要例如针条带大,所以会生成未知条带或沉淀。

处理惩罚步伐:在加热煮沸后,再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇,以增补不敷的还原剂;或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。

12.拖尾现象

主要是样品溶解结果不佳或疏散胶浓渡过大引起的。

处理惩罚步伐:加样前离心;选择适当的样品缓冲液,加适量样品促溶剂;电泳缓冲液时间过长,从头配制;低落凝胶浓度。

13.纹理现象

主要是样品不溶性颗粒引起的。

处理惩罚步伐:加样前离心;加适量样品促溶剂。

14.溴酚蓝不能起到指示浸染

我们在尝试中有时会呈现溴酚蓝已跑出板底,但卵白质却还未跑下来的现象。

主要原因:缓冲液和疏散胶的浓渡过高。

处理惩罚步伐:改换正确pH值的Buffer;低落疏散胶的浓度。

15.甘氨酸在电极缓冲液中的浸染

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